因业务调整,暂不接受个人委托测试,望谅解(高校、研究所等性质的个人除外).

　　原位杂交实验(FISH)是研究RNA表达、定位的常规实验技术手段。可以用于检测RNA表达，也可以用于在lncRNA、circRNA等特殊RNA类型中的亚细胞定位研究。

　　原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。

　　根据所用探针和靶 核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法 和间接法两类。

　　原位杂交可指示基因在细胞或组织环境中的表达位置。研究人员可使用带标记的 RNA 或 DNA 探针与样品中已知的靶 mRNA 或 DNA 序列杂交，然后利用抗体检测探针上的标记检出这些带标记的 RNA 或 DNA 探针。因此，这些探针可用于检测目标基因的表达水平和 mRNA 、lncRNA、miRNA、circRNA的位置。

样品保存

　　RNA 保存

　　RNase 酶的存在使 RNA 保存变得困难。此酶广泛存在于玻璃器皿上、试剂中以及操作人员身上及衣服上。RNase 可迅速破坏细胞中的 RNA 及 RNA 探针本身，因此用户的实验过程、手套和溶液需要保证无菌，防止探针或组织 RNA 受到 RNase 的污染。

　　冷冻切片的一般样品保存

　　为了使保存的载片获得不错结果，请勿将载片在室温环境下干燥保存。正确方法是，将其置于 100% 乙醇中-20 °C 保存，或将其用莎伦包装膜覆盖的塑料盒在 -20 °C 或 -80 °C条件下保存。这种保存方法可使载片保存数年。

探针选择

　　RNA 探针

　　RNA 探针长约 250–1500 个碱基;长度为800 个碱基左右的探针具有不错灵敏度和特异性。转录模板应支持探针(反义链)和阴性对照(正义链)RNA 的转录。将转录模板克隆至包含对生启动子的载体可实现这一目的。制备探针之前，必须对环状模板进行线性化，但也可使用 PCR 模板。

　　DNA 探针

　　DNA 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与RNA探针相比， DNA 探针与靶 mRNA 分子的杂交强度较弱，因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛。

　　探针特异性至关重要。如果已知细胞中 mRNA 或 DNA 的确切核苷酸序列，则可据此设计高度精确的互补探针。如果超过 5% 的碱基对不互补，那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着，探针更容易在洗涤和检测步骤中被洗去，可能无法正确检测。

(DIG) 标记 RNA 探针原位杂交实验方案

　　此方案介绍了如何使用 DIG 标记的 RNA单链 探针来检测石蜡包埋切片中目标基因的表达情况。

　　1) 脱蜡

　　对于冷冻切片，请从第 2 步开始操作。如果使用甲醛固定的石蜡包埋切片，请继续此步骤。

　　2) 抗原修复

　　将含 20 µg/mL 蛋白酶 K 的 50 mM Tris 预热并在 37 °C条件 下孵育酶解 10–20 分钟。孵育时间和蛋白酶 K 的浓度可能需要根据实际情况优化。

　　3) 使用蒸馏水清洗载片 5 次。

　　4) 将载片浸入预冷的 20% (v/v) 乙酸中 20 秒。这样可使细胞通透化，使探针或抗体能够透过。

　　5) 分别使用 70% 乙醇、95% 乙醇和 100% 乙醇洗涤载片(每次约 1 分钟)使其脱水，然后风干。

　　6) 向每个载片中加入 100 µL 杂交液。

　　7) 将载片置于所需杂交温度下的增湿杂交盒中孵育 1 小时。杂交温度的范围通常为 55–62 °C。

　　8) 在PCR 管中用杂交液稀释探针。利用PCR仪在 95 °C条件下加热RNA 或 DNA 2 分钟，使其变性。然后立即将探针置于冰上冷却，以防止重退火。

　　9) 除去杂交液。向每个切片加入 50–100 μL 探针稀释液，覆盖整个样品。在 65 °C 条件下在增湿的杂交盒中孵育过夜。用盖玻片盖住样品，以防样品蒸发。

　　在此步骤中，RNA 探针会与相应的 mRNA 杂交，或 DNA 探针会与相应的细胞 DNA 杂交。杂交温度的优化取决于所用的探针序列以及细胞或组织类型。所分析的每种组织类型都需进行杂交温度的优化。

　　探针的杂交温度取决于靶序列中碱基的百分比含量。序列中胞嘧啶和鸟嘌呤的比例是关键因素。

　　10) 严格洗涤

　　通过调节温度、盐浓度和洗涤剂浓度等溶液参数可消除非特异性相互作用。

　　11) 在室温下使用 MABT(含 Tween 20 的马来酸缓冲液)洗涤两次，每次 30 分钟。MABT 的性质比 PBS 更温和，更适用于DNA检测 。

　　12) 干燥载片。

　　13) 将其转移至增湿盒中，向每个切片加入 200 µL 封闭缓冲液(MABT + 2% BSA，牛奶或血清)。在室温下封闭 1–2 小时。

　　14) 去除封闭缓冲液。将抗标记抗体以所需稀释度加入封闭缓冲液。查看抗体说明书中推荐的浓度/稀释度。在室温下孵育 1–2 小时。

　　15) 在室温下使用 MABT 洗涤载片 5 次，每次 10 分钟。

　　16) 在室温下使用预染色缓冲液(100 mM Tris pH 9.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl2)洗涤载片 2 次，每次 10 分钟。

　　17) 如需进行荧光检测，请跳至第 18 步。对于其他形式的检测，请将载片放回增湿盒中，然后依照厂家说明书使其显色。

　　18) 使用蒸馏水清洗载片。

　　19) 将载片风干 30 分钟。然后使用 100% 乙醇进行洗涤，并将其彻底风干。

　　20) 使用 DePeX 封片溶液进行封片。